极端嗜热菌Thermosipho melanesiensis普鲁兰酶基因的异源表达与酶学性质分析

选择来源于极端嗜热菌Thermosipho melanesiensis(DSM12029)的普鲁兰酶基因,以购自德国菌种保藏中心的基因组为模板,扩增出普鲁兰酶基因TM-pulA;利用酶切酶连构建了重组质粒pET21a-TM-pulA;转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中诱导表达并经纯化后,进行了水解产物分析和酶学性质测定.结果显示:TM-pulA为Ⅰ型普鲁兰酶,最适pH为5.8;最适温度是80℃;70℃下半衰期为4.75 h;Mn~(2+)、Co~(2+)、AL~(3+)、Fe~(3+)、SDS及EDTA对其酶活有不同程度的抑制作用;该酶的K_m、V_(max)、K_(cat)及K_(cat)/Km值分别为4.68 g·L~(-1)、0.0085 mmol·L~(-1)·s~(-1)、71.18 s~(-1)、15.21 L·g~(-1)·s~(-1).     

杂色鲍♀×盘鲍♂合杂交受精的细胞学研究

应用组织学方法。研究了杂色鲍♀×盘鲍♂舍种间杂交受精过程的核相变化。结果表明杂色鲍♀×盘鲍♂种间杂交受精主要表现出两性融合的特点．盘鲍精子进入杂色鲍卵子。9min后中心粒发育为星光；精子头部逐渐膨大、液化形成雄性原核，39min后与雌性原核会合，而后融合．约3．2％的受精卵中观察到1个受精卵中同时存在3个即将融合的原核，这可能是多精入卵或卵子染色体组自发加倍的结果．42min后开始第1次有丝分裂。此时在极个别发育卵中发现固缩的染色质小体、微核、或分离不同步的染色体．     

栖热菌噬菌体TSP4密码子偏嗜性及其对基因异源表达的影响

 为了探索噬菌体TSP4、栖热菌模式菌株Thermus thermophilus HB27中6种蛋白编码序列和Escherichia coli基因组遗传密码子使用偏嗜性,探索TSP4基因密码子偏嗜性对其基因异源表达的影响本研究利用生物学软件Editseq和RSCU算法统计噬菌体TSP4密码子使用频率并分析其偏嗜性,与栖热菌HB27的同源基因以及常温菌E.coli基因组的密码子使用偏嗜性进行对比分析.结果显示,噬菌体TSP4与栖热菌HB27优势密码子相似度高达85%,而与E.coli的相似性仅有65%.为了验证分析结果,选取TSP4基因组中一个潜在分子伴侣基因序列在E.coli BL21和E.coli Rosetta(补充了BL21菌株中缺失的6个稀有密码子)中进行异源表达.噬菌体TSP4与其宿主菌HB27之间密码子高相似性说明在长期的进化过程中TSP4在基因水平上形成对宿主的一种适应性机制.异源表达结果显示,分子伴侣基因在E.coli BL21中未见明显表达,但在Rosetta中高效表达,说明Rosetta中补充的 6个稀有密码子明显有助于分子伴侣基因的表达,该结果也进一步证明密码子偏嗜性是否一致在很大程度上影响基因的表达.     

Salinispora arenicola CNP193新颖NRPS基因簇在Streptomycetes coelicolor M512中的异源表达

异源表达海洋专性放线菌salinispora arenicola CNP193新颖NRPS基因簇。PCR扩增基因簇两端各约1 000 bp的片段,融合PCR将两片段融合,同质粒pC AP01双酶切后连接,构建基因簇捕获载体pC AP01-preP KS/NRPS,通过TAR(transformation-associated recombination)克隆技术构建基因簇捕获质粒pC AP01-PKS/NRPS,运用三亲接合转移法将pC AP01-PKS/NRPS转化streptomycetes coelicolor M512。HPLC检测对照菌株和重组菌发酵液乙酸乙酯提取物初步表明基因簇有表达产物产生。为新颖salinispora arenicola CNP193新颖NRPS基因簇的鉴定奠定基础。     

雌核发育草鱼近交F_1代与普通草鱼外周血细胞的比较

利用光学显微镜和透射电子显微镜对雌核发育草鱼近交F_1代以及普通草鱼的外周血细胞进行了显微和超微结构的观察.在光镜下,雌核发育草鱼近交F_1代和普通草鱼外周血液中都可观察到6种不同类型的血细胞:红细胞、血栓细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞,两者基本相同.在透射电子显微镜下,在雌核发育草鱼近交F_1代的血细胞中观察到一种特殊的细胞,在普通草鱼中未观察到,两者其他血细胞结构基本相同.观察结果表明:雌核发育草鱼近交F-1代与普通草鱼的血细胞组成基本相同,但有细微区别.     

丝状真菌米曲霉外源基因表达系统的构建

以米曲霉Aspergillus oryzae RIB40的基因组DNA为模板,PCR扩增得到启动子、终止子、筛选标记基因等表达元件,依次连接到载体pUC119上,构建了米曲霉的重组表达载体pNMA. 将米赫根毛霉脂肪酶基因(RML)连接于pNMA的启动子下,得到表达载体pNMA-RML,通过ApaI酶切线性化转化米曲霉宿主菌A.oryzae niaD300,得到整合型的阳性转化子A.oryzae ONL1. 其培养7天的培养液上清在以三丁酸甘油酯为底物的平板上形成清晰的水解透明圈,碱滴定法酶活测定表明培养液酶活可达2.5 U/mL,培养液上清的SDS-PAGE图谱在32.5 kDa处有RML的特征条带. 以上结果表明RML已经在米曲霉中成功表达,同时证明所构建的米曲霉外源基因表达系统是有效的.     

外源基因在大肠杆菌中表达的优化

大肠杆菌已经被广泛地应用于表达各种外源基因,但基因的表达受多种因素的影响,现就各种影响因素综述了外源基因表达的优化策略,这将有助于采取有效方法提高外源基因在大肠杆菌中的表达效率.     

雌核发育彭泽鲫子代及双亲组织同工酶的比较研究

采用7．5％(ω)聚丙烯酰胺垂直板电泳技术研究了丰产鲫及其母本彭泽鲫和父本尖鳍鲤的心、肝、肾、脑4种组织的苹果酸酶(ME)、超氧化物歧化酶(SOD)和酯酶(EST)同工酶表型以及血清蛋白表型．结果表明：丰产鲫的血清蛋白和3种组织同工酶的电泳图谱均与母本彭泽鲫相同而与父本尖鳍鲤显著不同．说明丰产鲫是彭泽鲫卵子在尖鳍鲤精子激发下的雌核发育后代,在血清蛋白和同工酶表型的水平上,异源父本对子代成体的表型无影响。